脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）測試盒

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

DHAR存在于細胞質、線粒體和葉綠體中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsA和GSSG，調(diào)控細胞AsA/DHA比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，進而提高植物食品的營養(yǎng)品質。

測定原理：

DHAR催化GSH還原DHA生成AsA，通過測定DHA減少速率，計算DHAR活性。

實驗中所需儀器及設備：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體17.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

3.  血清等液體：直接測定。

DHAR測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL試劑三、20μL試劑四和140μL 試劑二，最后加20μL上清液迅速混勻后于265nm比色，記錄30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。

DHAR活性計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每104個細胞每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T

= 92×△A

ε ：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol /cm；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：比色杯光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL=2×10-4 L；V樣：反應體系中加入上清液體積，20μL =0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W ：樣品質量；T：反應時間，2 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每104個細胞每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 184×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T

= 184×△A

ε ：AsA在265nm處摩爾吸光系數(shù)為5.42×104 L/mol /cm；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體系總體積，0.2mL=2×10-4 L；V樣：反應體系中加入上清液體積，20μL =0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；W ：樣品質量；T：反應時間，2 min。

注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nèi)使用完。

上海牧榮生物科技有限公司

1. 國內(nèi)試劑耗材經(jīng)銷代理。

2. 國外試劑的訂購?？商峁W美實驗室品牌的采購方案。

3. 提供加急物流處理，進口貨物，最快交期1-2周。

4. 進出口貨物代理服務。

5. 公司代理眾多有名生命科學領域的研究試劑、儀器和實驗室消耗品品牌：CELL DATA,Alamanda Polymers， cstti，Click Chemistry tools，Nanoprobes，Ancell，NANOCS，Ambeed, Inc，SPEED BioSystems, LLC，Tulip Biolabs, Inc，Torrey Pines Biolabs，magsphere ,FabGennix International ,paratechs，Medicago,Oraflow,CWE,Wasatch Photonics, alphananote, It4ip, proteoform, Caprico等,重點合作品牌 Lee Biosolutions,chematech,Nanopartz,denovix,Atto tec,macrocyclics等。

6. 質量保證，所有產(chǎn)品都提供售后服務。付款方式靈活。公司堅持“一站式"服務模式，為客戶全面解決實驗、生產(chǎn)、開發(fā)需求。公司整合國際與國內(nèi)資源，加強網(wǎng)絡建設，提高公司內(nèi)部運作效率，為客戶提供方便、快捷的服務。

7. 公司突出創(chuàng)新思維，提高工作效能，減低運作成本，為客戶提供優(yōu)惠的價格。

脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）測試盒