1. 清潔樣品表面

對于每種細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，樣品表面必須清潔。任何污染都可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。手動細(xì)胞計(jì)數(shù)包括移除和清潔玻璃蓋玻片，然后用 70% 乙醇和水清潔計(jì)數(shù)室。使用一次性塑料載玻片時(shí)，每個(gè)樣品（如果載玻片有兩個(gè)腔室，則為一對樣品）都需要一張新的載玻片。

使用 CellDrop 系列儀器，腔室在兩個(gè)彼此平行的光學(xué)級藍(lán)寶石表面之間形成。樣品在表面之間移液，并通過表面張力固定到位。要清潔表面，只需用干燥的實(shí)驗(yàn)室濕巾擦拭即可。

如需進(jìn)一步清潔，用 15 μL 70% 乙醇或 10% 漂白劑沖洗腔室。加載后，讓溶液靜置 ~10 秒，然后用實(shí)驗(yàn)室干抹布清潔表面。

2. 加載前立即混合

在加載樣品之前立即混合對于確保分析樣品的代表性至關(guān)重要。

不同大小和類型的像元將以不同的速率沉降和聚集。在上樣前立即混合溶液可增加等分試樣均勻并準(zhǔn)確反映細(xì)胞培養(yǎng)物特性的可能性。

3. 減少細(xì)胞聚集

細(xì)胞計(jì)數(shù)需要分析整個(gè)儲備液中的少量樣品，因此必須注意確保樣品具有原始儲備培養(yǎng)物的代表性。雖然像 CellDrop 這樣的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀應(yīng)用算法來識別團(tuán)塊中的細(xì)胞，但它們無法校正不具有代表性的樣品。手動計(jì)數(shù)時(shí)，團(tuán)塊的評分比單個(gè)細(xì)胞更主觀，這增加了用戶之間的可變性。

細(xì)胞裂解后的細(xì)胞外 DNA 和細(xì)胞碎片是結(jié)塊的常見原因。細(xì)胞裂解可能是由過度生長、過度移液造成的機(jī)械剪切、凍融循環(huán)以及胰蛋白酶消化不足或過度引起的，也可能導(dǎo)致樣品異質(zhì)性。通過避免細(xì)胞裂解的原因和過濾樣品中的細(xì)胞碎片，可以減少細(xì)胞團(tuán)塊。

4. 優(yōu)化設(shè)置

無論是手動計(jì)數(shù)還是依靠軟件算法進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整對焦和曝光設(shè)置以確保細(xì)胞的最佳可見性以獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果都很重要。

最佳對焦和曝光將顯示細(xì)胞膜和背景之間的鮮明對比。

針對熒光應(yīng)用單獨(dú)優(yōu)化每個(gè)熒光通道的能力將產(chǎn)生最可重現(xiàn)的結(jié)果。應(yīng)設(shè)置熒光強(qiáng)度以確保細(xì)胞在保持其實(shí)際大小的同時(shí)盡可能明亮。光線不應(yīng)滲過細(xì)胞的邊緣。

5. 使用適當(dāng)?shù)那皇腋叨?/span>

有一系列血球計(jì)數(shù)器可供選擇，深度和網(wǎng)格設(shè)計(jì)各不相同。請注意在計(jì)算中使用正確的詳細(xì)信息以避免錯(cuò)誤。

CellDrop 具有一定的功能，與其他基于玻片的計(jì)數(shù)儀相比，可實(shí)現(xiàn)更寬的細(xì)胞密度范圍。裝載室高度可通過軟件進(jìn)行調(diào)整，以適應(yīng)最寬的細(xì)胞密度和粒徑范圍。提供屏幕指導(dǎo)以確保最佳高度，并自動調(diào)整計(jì)算。

6. 調(diào)整計(jì)數(shù)參數(shù)

大多數(shù)自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀都包含可調(diào)整的設(shè)置，以最好地匹配正在研究的細(xì)胞。例如，可以設(shè)置并保存像元大小范圍，以從分析中排除碎片或其他像元群。

還提供了用于定義單元格形狀的設(shè)置。對于 CellDrop，可以在細(xì)胞計(jì)數(shù)之前或之后調(diào)整設(shè)置，并根據(jù)新參數(shù)重新分析數(shù)據(jù)。

7. 選擇明場或熒光

明場分析可有效計(jì)數(shù)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。然而，使用臺盼藍(lán)可能很難區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，并且對于許多原代細(xì)胞，需要熒光。

例如，外周血單核細(xì)胞 （PBMC） 通常與大量紅細(xì)胞 （RBC） 混合，使用明場分析可能顯示為“死亡"。然而，使用吖啶橙 （AO） 和碘化丙啶 （PI） 等染料，可以僅對有核 PBMC 進(jìn)行染色，并使用雙重?zé)晒夤δ軈^(qū)分活體和死體。

AO 和 PI 都可以對核酸進(jìn)行染色，但只有 AO 可以穿過活細(xì)胞膜。因此，活的 PBMC 用 AO 染色并發(fā)出綠色熒光，死的 PBMC 用 AO 和 PI 染色并發(fā)出紅色熒光。紅細(xì)胞未染色，根本不發(fā)出熒光。