重組蛋白廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。由于可用于商業(yè)用途的簡單方法的發(fā)展，重組蛋白的表達(dá)變得越來越普遍。最重要的是，它極大地增加了可以進(jìn)行結(jié)構(gòu)和生化研究的蛋白質(zhì)數(shù)量。由于每種蛋白質(zhì)都是不同的，因此必須針對每種特定蛋白質(zhì)開發(fā)純化方法和技術(shù)，同時(shí)牢記蛋白質(zhì)的預(yù)期應(yīng)用。

我們討論了影響的眾多參數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)以及如何修改它們以提高它們在不同系統(tǒng)中的產(chǎn)量。

重組蛋白到底是什么？

重組蛋白被描述為“由重組DNA編碼的定制或修飾的蛋白"在合適的表達(dá)載體中編碼所需基因的質(zhì)粒在特定的宿主表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，以產(chǎn)生一定量的蛋白質(zhì)用于科學(xué)研究、治療或診斷目的。

重組蛋白的大量應(yīng)用包括如下:

• 生化過程的研究，
• 接種疫苗，
• 蛋白質(zhì)的三維檢測

• 生物技術(shù)和治療實(shí)踐中的應(yīng)用。

產(chǎn)生重組蛋白需要將相關(guān)基因復(fù)制到表達(dá)載體中，同時(shí)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控。

然而，成功表達(dá)重組基因需要幾個(gè)變量，包括正確的蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞生長性狀以及轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的適當(dāng)表達(dá)指標(biāo)。在細(xì)菌表面展示重組蛋白在生物技術(shù)中有許多可能的用途；然而，這需要對通常在作為融合伴侶的載體蛋白上發(fā)現(xiàn)的靶向基序有更深入的理解。

此外，選擇表達(dá)系統(tǒng)需要了解開發(fā)、維持和其他經(jīng)濟(jì)因素的成本。

用于生產(chǎn)重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)

基因工程已經(jīng)使在細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物甚至動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)有價(jià)值的重組蛋白成為可能植物細(xì)胞。這種生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，到2025年，其市場價(jià)值預(yù)計(jì)將達(dá)到4000億美元。

因?yàn)槊糠N宿主細(xì)胞都是不一樣的，所以不同的蛋白質(zhì)表達(dá)方法產(chǎn)生具有不同生物活性和穩(wěn)定性水平的重組蛋白質(zhì)并不罕見。糖蛋白包含超過50%的人類蛋白質(zhì)和大約四分之一的工業(yè)重組藥物蛋白質(zhì)。為了從這些重組蛋白中提取最多的蛋白質(zhì)，通常需要真核細(xì)胞作為糖基化的宿主。

雖然大多數(shù)商業(yè)生物仿制藥是使用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞制造的，但治療性重組蛋白的表達(dá)受到動(dòng)物宿主細(xì)胞易受反饋抑制的限制。此外，昂貴的血清或生長因子的高制造成本和流行的動(dòng)物感染的生物安全問題促使科學(xué)家們尋求非動(dòng)物來源的真核細(xì)胞表達(dá)方法。由于其有利的特征，包括低生產(chǎn)成本、高生物安全性和蛋白質(zhì)后修飾特征，植物細(xì)胞是合成藥物重組蛋白的優(yōu)選。

由于目前正在進(jìn)行臨床研究的許多生物制藥蛋白質(zhì)，如治療性蛋白質(zhì)、抗原和抗體的有效表達(dá)，植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)獲得了國際關(guān)注。然而，細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)仍然是商業(yè)水平上的好系統(tǒng)。

細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

說到生產(chǎn)重組蛋白，大腸桿菌是常見的來源之一。雖然大部分重組蛋白是在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的，但二硫鍵結(jié)合的重組蛋白經(jīng)常是在周質(zhì)中合成的。

氧化棲息地和駐留二硫鍵形成(Dsb)-系統(tǒng)可以通過將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)向周質(zhì)來增強(qiáng)適當(dāng)?shù)亩蜴I。將周質(zhì)用于具有二硫鍵的重組蛋白更好，但是穿過細(xì)胞質(zhì)屏障的靶向問題會顯著降低周質(zhì)產(chǎn)量。

讓我們看看涉及的因素和條件蛋白質(zhì)表達(dá)優(yōu)化在細(xì)菌蛋白質(zhì)系統(tǒng)中。

蛋白質(zhì)序列和基因?qū)扇苄院捅磉_(dá)的影響

導(dǎo)致異源蛋白質(zhì)不表達(dá)的一個(gè)普遍因素是在感興趣的mRNA中存在“奇怪的"密碼子。有可能通過密碼子增強(qiáng)的基因生產(chǎn)來避免這種密碼子異常。基因合成的一個(gè)好處是，它讓你改變基因的密碼子偏好，以便更好地與雜交宿主合作。

用不常見的tRNAs加強(qiáng)的表達(dá)批次可以克服大腸桿菌重組基因中固有的密碼子異常。

表達(dá)產(chǎn)量和溶解度都受到靶結(jié)構(gòu)域起始和末端殘基的影響。通過分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，我們可以找到構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的最佳位置。通過將感興趣的蛋白質(zhì)序列與同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相匹配，有可能確定結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)未知的蛋白質(zhì)的合適結(jié)構(gòu)域邊界。如果你沒有獲得同源蛋白質(zhì)復(fù)合物的途徑，你應(yīng)該使用二級解剖部分的預(yù)測。

載體對溶解性和表達(dá)的影響

DNA序列的某些部分，如Shine-Dalgarno盒、啟動(dòng)子、調(diào)控序列、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制源等，控制所需基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄。此外，選擇元件被整合到表達(dá)載體中以促進(jìn)質(zhì)粒在靶細(xì)胞中的選擇。包含融合標(biāo)簽是大腸桿菌表達(dá)載體的另一個(gè)基本部分。

當(dāng)選擇啟動(dòng)子框架時(shí)，應(yīng)該考慮下游應(yīng)用和蛋白質(zhì)靶類型。當(dāng)處理潛在有害的蛋白質(zhì)時(shí)，選擇基礎(chǔ)輸出水平較低的啟動(dòng)子系統(tǒng)是明智的。另一方面，為了盡可能提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量，必須選擇更有效的啟動(dòng)子。對于易于聚集的蛋白質(zhì)，可以考慮的一個(gè)選擇是使用冷休克啟動(dòng)子，允許在較低的溫度下表達(dá)。

來自細(xì)菌和其他更大的生物的蛋白質(zhì)通常折疊更長時(shí)間并粘在一起。在大腸桿菌中，折疊催化劑和蛋白質(zhì)伴侶可以用來防止蛋白質(zhì)粘在一起，同時(shí)使折疊更容易。兩種蛋白質(zhì)，一種在靶質(zhì)粒上編碼，另一種在獨(dú)立的質(zhì)粒上編碼，可以共表達(dá)。

融合標(biāo)簽在基因水平上附著在特定的蛋白質(zhì)上，使它們更易溶解或更容易被發(fā)現(xiàn)和純化。你通常必須嘗試幾種不同的標(biāo)簽，才能知道哪種融合標(biāo)簽?zāi)墚a(chǎn)生最易溶解的蛋白質(zhì)。此外，標(biāo)簽的定位至關(guān)重要，它可以位于感興趣的蛋白質(zhì)的C-末端或N-末端。大多數(shù)融合涉及N-末端，這種融合有一個(gè)優(yōu)勢:與C-末端的對應(yīng)蛋白相比，它通常提高了可溶性蛋白的表達(dá)。

考慮到融合標(biāo)簽的可用性可能阻礙重組合成蛋白的生物學(xué)功能，在融合蛋白純化后酶促消除標(biāo)簽可能是有用的。為了便于標(biāo)簽的去除，建議整合一個(gè)對給定序列*特的蛋白酶的分割部分。

宿主原種對異源蛋白表達(dá)的影響

細(xì)菌變體宿主的發(fā)展可以促進(jìn)異源蛋白質(zhì)的合成。一些商業(yè)銷售的大腸桿菌變異體被改造成產(chǎn)生具有特定特征的蛋白質(zhì)，例如那些易受蛋白水解、具有不尋常密碼子或需要二硫鍵的蛋白質(zhì)。

蛋白酶缺陷型變體，如大腸桿菌BL21或該菌株的其他變體，被推薦用于易受蛋白水解破壞的蛋白質(zhì)。當(dāng)靶基因和表達(dá)宿主的密碼子頻率不同時(shí)，會發(fā)生氨基酸誤摻入、翻譯過早終止和翻譯停滯。如果不尋常的tRNAs在表達(dá)過程中被提供，這種差異將成為過去。使用具有編碼稀有tRNAs的質(zhì)粒的細(xì)菌菌株，可以提高含有*特密碼子峰值頻率的基因的產(chǎn)量。

通過在包括谷胱甘肽還原酶(gor)和硫氧還蛋白還原酶(trxB)的宿主菌株中表達(dá)，可以提高含有二硫鍵的折疊蛋白的溶解性，并有助于胞質(zhì)二硫鍵的產(chǎn)生。大腸桿菌周質(zhì)氧化性很強(qiáng)，有利于二硫鍵的產(chǎn)生；在這種環(huán)境中靶向產(chǎn)生的蛋白質(zhì)提供了表達(dá)含有二硫化物的蛋白質(zhì)的替代技術(shù)。

通過調(diào)節(jié)表達(dá)增加蛋白質(zhì)溶解度

使用有效的生產(chǎn)啟動(dòng)子和高濃度的誘導(dǎo)劑可以在折疊前發(fā)生蛋白質(zhì)聚集。如果轉(zhuǎn)錄和翻譯速率降低，新生成的蛋白質(zhì)在聚集之前將有更多的時(shí)間折疊。為了提高蛋白質(zhì)的溶解性，可以調(diào)整以下幾個(gè)典型方面的表達(dá)。

溫度:如果生產(chǎn)溫度降低到15-25 ℃,重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將更易溶解。降低的蛋白質(zhì)收集、翻譯、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂速率是由于在較低溫度下細(xì)胞過程變慢。當(dāng)表達(dá)特定蛋白質(zhì)的溫度降低時(shí)，易受蛋白水解影響的蛋白質(zhì)的分解速度減慢。

引發(fā)劑的效力:重組蛋白的溶解性和活性可以通過降低轉(zhuǎn)錄速率來增強(qiáng)，這可以通過降低誘導(dǎo)劑的濃度來實(shí)現(xiàn)。

選擇的媒介:最重組蛋白生產(chǎn)通過分批培養(yǎng)來培養(yǎng)細(xì)胞。從一開始就將所有必需的營養(yǎng)物質(zhì)加入到生長培養(yǎng)基中是至關(guān)重要的。

優(yōu)化蛋白質(zhì)的純化

• 固定化金屬親和色譜(IMAC)應(yīng)該用作純化過程的第一階段。

• 當(dāng)需要進(jìn)一步純化時(shí)，使用凝膠過濾或尺寸排阻色譜法。必要時(shí)，離子交換色譜應(yīng)該作為“純化"的最后一步

• 有可能刪除親和標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)額外的純化并減少重組蛋白中存在的非原始序列的數(shù)量。

為大腸桿菌開發(fā)最佳表達(dá)系統(tǒng)

根據(jù)科學(xué)界目前的信息，建議開發(fā)一種適合大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)是安全的。它應(yīng)由促進(jìn)有效轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物、使翻譯穩(wěn)定、產(chǎn)生真正的重組蛋白而不被截短或延伸的變體污染、保持溶解性并聚集到總細(xì)胞蛋白的約20%的DNA成分組成。

這種類型的表達(dá)整合了管家啟動(dòng)子s70所確認(rèn)的共有啟動(dòng)子，并且它可以通過整合UP元件而經(jīng)歷額外的改善。誘導(dǎo)相鄰基因的通讀轉(zhuǎn)錄受到兩個(gè)缺乏任何因子的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子的串聯(lián)排列的阻礙。

在轉(zhuǎn)錄物兩端發(fā)現(xiàn)的反向重復(fù)穩(wěn)定了轉(zhuǎn)錄物本身。這些重復(fù)序列可以產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙5’端的核酸內(nèi)切酶活性和3’端的核酸外切酶破壞，但它們不抑制翻譯。最后，彈性Shine-Dalgarno序列、下游8bp的AUG起始密碼子和延長的UAAU終止密碼子確保了有效的翻譯。折疊分子伴侶隨著新的多肽鏈同時(shí)表達(dá)，幫助它們折疊。

然而，有必要指出這樣一個(gè)結(jié)論，即所有的重組蛋白都沒有一種*美生產(chǎn)方法。每種蛋白質(zhì)都有其挑戰(zhàn)。為了實(shí)現(xiàn)高度的合成，有必要通過系統(tǒng)地調(diào)整各種參數(shù)來優(yōu)化每種情況下的工藝。

結(jié)論

出于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，科學(xué)家采用許多策略來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。與非常容易制造的DNA不同，蛋白質(zhì)只能由細(xì)胞或活組織的復(fù)雜混合物制造。通過特定表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白的努力可能會從令人滿意且相對快速的操作迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫o張且耗時(shí)的過程。通過上述步驟，研究人員和科學(xué)家可以使用重組蛋白表達(dá)服務(wù)來克服這些障礙。

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