故障排除

以下故障排除指南旨在解釋蛋白質(zhì)印跡中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。

Simple Western™ 可以克服傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法中需要排除故障的許多挑戰(zhàn)，它可以在臺(tái)式儀器內(nèi)自動(dòng)執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法的傳統(tǒng)步驟。 Simple Western 使用毛細(xì)管電泳，消除了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡的凝膠到印跡轉(zhuǎn)移，提供定量和可重復(fù)的結(jié)果。了解有關(guān)Bio-Techne 品牌 ProteinSimple 的Simple Western 儀器的更多信息。

無信號或信號弱

一抗?jié)舛忍?/strong>

• 增加一抗的濃度（滴定可能有幫助）。Novus 抗體濃度試劑盒可用于增加一抗?jié)舛取?/span>

• 將孵育時(shí)間延長至 4°C 過夜

• 如果一抗重復(fù)使用次數(shù)過多，則有效抗體濃度可能太低；使用新鮮抗體來改善信號

目標(biāo)蛋白濃度太低

• 每孔加載更多蛋白質(zhì)（滴定可能有幫助）

• 使用已知表達(dá)目標(biāo)蛋白的陽性對照裂解物、過表達(dá)裂解物或重組蛋白

• 確保裂解緩沖液是目標(biāo)蛋白的最佳緩沖液；裂解緩沖液根據(jù)靶蛋白定位而有所不同。

• 如果需要增加非豐度蛋白質(zhì)的濃度，請使用免疫沉淀或分級分離（即核分級分離）

• 在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑

• 確保樣品未降解

蛋白質(zhì)從凝膠到膜的轉(zhuǎn)移不成功

• 通過膜的麗春紅染色或凝膠的考馬斯染色確認(rèn)蛋白質(zhì)已成功轉(zhuǎn)移到膜上。

• 通過分析加載控制表達(dá)式確認(rèn)等量轉(zhuǎn)移

一抗和二抗不兼容

• 確保二抗是針對產(chǎn)生一抗的物種而產(chǎn)生的

• （例如，如果一抗是在小鼠中產(chǎn)生的，則使用抗小鼠二抗）

膜選擇不理想

• 檢查抗原序列的疏水性/親水性。 PVDF 膜可能更適合親水性/極性/帶電抗原，而硝酸纖維素膜可能更適合疏水性/非極性抗原

存在阻塞問題

• 封閉時(shí)間過長會(huì)掩蓋某些表位并抑制抗體結(jié)合；減少封閉孵育時(shí)間或封閉液濃度

• 切換到不同的阻塞解決方案

膜沖洗過度

• 隨著時(shí)間的推移，檢測試劑可能會(huì)變得不活躍。確保試劑新鮮。二抗可以通過將其點(diǎn)在膜上并與檢測試劑一起孵育印跡來進(jìn)行測試。

• 處理低豐度蛋白質(zhì)時(shí)，使用更靈敏的試劑（滴定可能有幫助；如果稀釋，請使用高純水）

圖像曝光時(shí)間太短

• 增加曝光時(shí)間（多次檢查以達(dá)到最佳曝光時(shí)間）

抗體僅識別天然蛋白質(zhì)

• 如果使用僅識別天然蛋白質(zhì)的抗體，請勿使用還原的變性蛋白質(zhì)

目標(biāo)是低分子量

• 減少傳輸時(shí)間以防止過度傳輸。對于小蛋白質(zhì)以及孔徑較小的膜（0.2 μm 與 0.45 μm），建議使用濕轉(zhuǎn)法

發(fā)生疊氮hua鈉污染

• 疊氮hua鈉（通常用于儲(chǔ)存一抗）會(huì)抑制 HRP 活性。確保充分洗滌以去除疊氮hua鈉的存在或使用不含疊氮hua鈉的緩沖液。

高均勻背景

阻擋不足

• 增加封閉時(shí)間和/或溫度

• 增加封閉劑的濃度（嘗試達(dá)到10%）

• 考慮更換封閉劑（牛奶與 BSA）

• 在抗體緩沖液中加入可選的封閉劑（也可以增加百分比）

阻止不兼容

• 對于磷酸化蛋白質(zhì)的檢測，不建議使用牛奶（牛奶和酪蛋白富含磷酸化蛋白質(zhì)）

由于高抗體濃度導(dǎo)致非特異性結(jié)合

• 降低初級或次級的濃度（滴定可能有幫助）

• 在抗體緩沖液中加入封閉劑

• 通過執(zhí)行二抗對照來確認(rèn)二抗的特異性：省略一抗，僅將印跡與二抗一起孵育。

未結(jié)合的抗體洗滌不充分

• 增加洗滌次數(shù)和/或時(shí)間

干膜

• 確保在蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)過程中膜永遠(yuǎn)不會(huì)變干

膠片曝光時(shí)間太長

• 降低曝光時(shí)間（可能需要測試一系列曝光時(shí)間）

檢測試劑過于敏感

• 用純水稀釋檢測試劑或使用靈敏度較低的檢測試劑

非特定條帶/尺寸錯(cuò)誤或多條帶

目標(biāo)蛋白豐度低于非特異性結(jié)合閾值

• 在 SDS-PAGE 凝膠中加載更多蛋白質(zhì)

• 通過免疫沉淀或分級分離富集低豐度蛋白質(zhì)

樣品降解

• 使用新鮮裂解物

• 將樣品放在冰上，直到樣品緩沖液添加和沸騰之前

• 如果檢測磷酸化靶標(biāo)，則始終包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑

可能存在其他蛋白質(zhì)亞型

• 可能存在選擇性剪接或多聚體形成。在這種情況下，可能需要異構(gòu)體特異性抗體。

可能存在翻譯后修飾

• 預(yù)測的分子量可能受到許多因素的影響，例如糖基化、磷酸化和蛋白質(zhì)加工（從前體形式裂解為成熟形式）。為了確認(rèn)特異性，進(jìn)行陽性和陰性對照，例如重組蛋白或過表達(dá)裂解物、下調(diào)的敲低/敲除裂解物

有斑點(diǎn)或漩渦的背景

膜處理不當(dāng)

• 盡量減少與膜的接觸。使用干凈的工具處理膜

緩沖液污染

• 制作新鮮的緩沖液

氣泡

• 轉(zhuǎn)移前滾平凝膠和膜之間的所有氣泡

HRP聚合

• 使用 0.2 μm 過濾器過濾二抗以去除聚集物

洗滌不足

• 增加洗滌緩沖液的體積

• 增加洗滌次數(shù)和/或持續(xù)時(shí)間

其他事宜

白色/空心帶

• ECL 底物消耗太快。降低一抗/二抗?jié)舛然驕p少蛋白質(zhì)用量

條帶/泳道涂污（樣品超載）

• 每個(gè)泳道中加載較少的蛋白質(zhì)

分子量標(biāo)記泳道為黑色

• 抗體可能與分子量標(biāo)記發(fā)生反應(yīng)

• 在分子量標(biāo)記和第一個(gè)樣品泳道之間添加空白泳道